PEMBUATAN MEDIA DAN STERILISASI

PEMBUATAN MEDIA DAN STERILISASI

I. Tujuan Praktikum
    1. Dapat melakukan pembuatan media
    2. Dapat melakukan sterilisasi alat dan media
II. Tinjauan Pustaka
Mahluk hidup yang ada di bumi tidak hanya terdiri dari makhluk hidup yang dapat dilihat oleh mata telanjang, tetapi ada juga mikroorganisme yang berukuran kecil dan hanya dapat dilihat dengan menggunakan teknik dan peralatan khusus. Mikroorganisme (jasad renik) merupakan jasad hidup yang mempunyai ukuran sangat kecil. Mikroorganisme mempengaruhi kehidupan manusia baik secara langsung maupun tidak langsung yang bisa berdampak positif maupun negatif bagi kehidupan manusia (Kusnadi, 2003).
Untuk menelaah mikroorganisme di laboratorium, kita harus dapat menumbuhkan mereka. Mikroorganisme dapat berkembang biak dengan alami atau dengan bantuan manusia. Mikroorganisme yang dikembangkan oleh manusia diantaranya melalui substrat yang disebut media. Untuk melakukan hal ini, haruslah dimengerti jenis-jenis nutrien yang diisyaratkan oleh bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhannya (Mila, 2005).
Media adalah suatu substansi yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembang biakan jasad renik (mikroorganisme). Media dapat berbentuk padat, cair dan semi padat (semi solid) . Didalam laboratorium mikrobiologi, kultur media sangat penting untuk isolasi, pengujian sifat-sifat phisis dan biokhemis bakteria serta untuk diagnosa suatu penyakit . Zat makanan yang dibutuhkan bakteri pada umumnya sangat bervariasi, dapat berbentuk senyawa-senyawa organik sederhana atau senyawa-senyawa organik komplek (majemuk). Untuk menumbuhkan bakteri pada tanah cukup dengan mempergunakan senyawa organik sederhana, tetapi bakteri patogen membutuhkan media yang mengandung ekstrak daging bagi pertumbuhan dan perkembang biakannya. Ekstrak daging mengandung antara lain : asam-asam amino dan pepton (Supar dan Ibrohim,
1981) . Pepton adalah sebagai sumber/persediaan nitrogen bagi pertumbuhan bakteri, mudah larut dalam air, tidak rusak/menggumpal pada suhu tinggi dan juga berfungsi sebagai buffer (penyangga) . Pepton dapat dibuat dengan pengasaman atau hidrolisa dengan enzym dari protein hewani atau protein nabati, seperti : otot, hati, darah, susu, kasein, laktalbumin, gelatin dan kacang kedelai (Cowan, 1975) .
Medium atau media agar adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrisi yang banyak dipakai untuk isolasi, memperbanyak, pengujian, sifat-sifat fisiologi dan juga untuk perhitungan mikroba. Medium dapat dibedakan menjadi tiga macam, berdasarkan susunan kimia yaitu medium organik, medium anorganik, medium sintetik dan medium nonsintetik. Berdasarkan fungsinya yaitu  medium diperkaya, medium spesifik, medium diferensiasi, medium penghitung dan medium penguji(Suriawiria, 2005).
Dalam medium harus ada nutrisi yang merupakan kebutuhan dasar dari mikroorganise yang meliputi air, karbon, energi dan mineral. Air sangat berperan penting karena air merupakan komponen dasar protoplasma, jalan masuknya nutrien kedalam sel, dan juga reaksi enzimatik. Air yang baik digunakan dalam pembuatan medium organisme adalah air suling, karena kalau air sadah yang digunakan  untuk pembuatan medium yeng terbentuk dari ekstrak dari ekstrak daging dan pepton maka akan terbentuk endapan fosfat dan magnesium fosfat. Dengan adanya endapan tersebut maka akan menghambat bagi pertumbuhan biakan yang di tanam dalam medium(Dwidjoseputro, 2002).
Pertumbuhan bakteri selain memerlukan nutrisi, juga memerlukan pH yang tepat. Kebanyakan bakteri tidak dapat tumbuh pada kondisi yang terlalu basa, kecuali Vibrio cholerae yang dapat hidup pada pH lebih dari 8. Suhu juga merupakan variabel yang perlu dikendalikan. Kelompok terbesar yaitu mesofil, suh optimum untuk pertumbuhannya 20-40oC (Suryanto, 2006).
Media adalah substansi yang terdiri atas campuran zat-zat makanan yang dipergunakan untuk pemeliharaan dan pertumbuhan mikroorganisme. Mikroorganisme juga merupakan mahluk hidup, untuk memeliharanya dibutuhkan medium yang harus mengandung semua zat yang diperlukan untuk pertumbuhannya, yaitu antara lain senyawa-senyawa organik (protein, karbohidrat, lemak, mineral, dan vitamin). Medium digunakan untuk melihat gerakan dari suatu gerakan mikroorganisme apakah bersifat motil atau non motil, medium ini ditambahkan bahan pemadat 50% (Sutarma,2000).
Secara umum medium dapat dibedakan atas medium alami maksudnya medium yang murni berasal dari alam, medium semi buatan yaitu campuran bahan-bahan kimia dan bahan alami, sedangkan medium buataan adalah medium yang seluruhnya dibuat oleh manusia. Menurut Yusuf Hidayat (2000) Berdasarkan konsistensi atau kepadatannya, medium dibagi menjadi tiga jenis, yaitu :
1. Medium padat (solid medium) yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga    setelah dingin media menjadi padat.
2. Medium setengah padat (semi solid medium) yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan dibawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.
3. Medium cair (liquid medium) yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).
4. Medium semi solid dan solid menggunakan bahan pemadat (seperti amilum, gelatin, selulosa dan agar-agar). Untuk medium padat/solid kita dapat menggunakan agar-agar dengan kadar 1,5%-1,8%, dan pada medium  semi solid  kadarnya setengah dari medium  padat,  sedangkan  pada  medium cair  tidak  diperlukan  pemadat. (Yusuf Hidayat,2000)

Pembuatan medium Nutrien Agar (NA) menggunakan bahan utama beef ekstrak 5 g, peptom 3 g dan agar 3 g. Pada awal pengamatan medium Nutrien Agar, sebelum proses sterilisasi berwarna kuning, setelah sterilisasi warna medium menjadi agak coklat. Pada pembuatan medium NA ini ditambahkan pepton agar mikroba cepat tumbuh, karena mengandung banyak N2 (Dwidjoseputro, 1994). Agar yang digunakan dalam proses ini untuk mengentalkan medium sama halnya dengan yang digunakan pada medium PDA yang juga berperan sebagai media tumbuh yang ideal bagi mikroba (Schlegel 1993).
Tahapan pembuatan media yaitu Penimbangan, penggunaan pelarut dan wadah, Pengukuran derajat keasaman (pH), Pengisian dan Sterilisasi, Kontrol sterilitas, uji pertumbuhan dan penyimpanan. Penimbangan, penggunaan pelarut dan wadah dilakukan dengan Media yang akan dibuat selain yang siap pakai, artinya untuk membuatnya tinggal menimbang dengan jumlah tertentu kemudian melarutkannya, ada pula yang harus diramu dengan komposisi yang ditentukan (Anonymous, 1994) . Timbangan yang praktis dipakai adalah timbangan "top loading" Sartorius yang mempunyai angka 2 atau 3 desimal (2 atau 3 angka dibelakang koma) . Aquadest digunakan sebagi pelarut untuk  menghindari adanya bahan-bahan yang dapat mempengaruhi kelarutan, wadah tempat melarutkan, jika jumlahnya sedikit dipakai alat-alat gelas seperti erlenmeyer atau gelas piala, jika pembuatannya dengan jumlah banyak dipakai ember yang terbuat dari stainless . Wadah dari tembaga atau seng tidak digunakan untuk menghindari terjadinya kelarutan pada kedua metal tersebut, karena keduanya diketahui mudah teroksidasi dan korosif. Jumlah sekecil apapun dari kedua metal ini jika terlarut dalam media akan bersifat sebagai bakterisidal (Collin dan Patricia, 1987) .
Pengukuran derajat keasaman atau eksponen hidrogen (pH) media sangat penting. Jika terlalu asam atau basa, maka pertumbuhan bakteri akan dihambat . Hampir semua bakteri tumbuh pada media pH 7 .00 - 7 .50, dan hanya beberapa saja yang tumbuh pada media yang pH nya dibawah 7 .0, misalnya Mycobakterium, yaitu bakteri tahan asam yang tumbuh pada media pH 6 .8 . Pengukuran pH hendaknya dilakukan pada suhu kamar, untuk menghindari penyimpangan/kesalahan . Pengukuran bisa dilakukan dengan : kertas penunjuk (indikator), pH meter elektrik dan zat penunjuk. Untuk memperoleh pH media yang kehendaki, jika terlalu rendah dipakai tetesan larutan NaOH I N, sebaliknya jika terlalu tinggi diturunkan dengan tetesan larutan HCL' 1 N. Zat penunjuk dipakai khususnya pada media diferensial yang mengandung karbohidrat atau unsur karbon lain, digunakan untuk mempelajari sifat-sifat bakteri . Jika penunjuk yang dipakai adalah phenol red, maka warna media adalah merah, karena pH 7 .0 - 7.5.
Pengisian media yang sudah diukur pH nya kedalam tabung/botol sebaiknya jangan terlalu penuh untuk menghindari tumpah atau pecah jika disterilkan. Untuk bentuk padat yang mengandung 2% agar-agar atau bentuk semi solid yang mengandung 0,2% - 0,5% agar-agar, sehelum diisikan harus dipanaskan dahulu supaya agarnya larut dan homogen. Sedangkan untuk pembuatan media agar plat. dimasukan kedalam erlenmeyer yang kemudian ditutup dengan kapas/alumunium foil . Media dalam tabung, botol atau erlenmeyer, kemudian disterilkan dengan uap air jenuh bertekanan (autoclave) . Pada proses ini ada hubungan antara suhu yang diinginkan dengan tekanan uap airnya Dengan sterilisasi sel-sel vegetatif dan spora bakteri akan mati . Jika media tersebut mengandung bahan-bahan yang tidak bisa disterilkan dengan autoclave, dapat disterilkan dengan uap air yang mengalir, suhunya 100°C (steam) . Lama sterilisasi dengan steam bervariasi antara 10 - 30 menit, tergantung bahan yang disteril, media yang mengandung selenit atau tetrationat cukup 10 menit, dan untuk karbohidrat 30 menit (Cowan, 1975) . Untuk mensterilkan bahanbahan yang tidak tahan terhadap panas, misal serum, beberapa macam vitamin dilakukan sterilisasi dengan menggunakan saringan, yaitu mengunakan kertas saring ashes (SEITZ EK), dengan bantuan pompa vakum yang bisa menyedot atau menekan udara.Sedangkan untuk mensterilkan alat-alat gelas, dipakai sterilisasi panas kering (hot air open), suhunya 160°C selama I jam atau 170°C selama 40 menit (Collin dan Patricia, 1987) . Pada pengisian kedalam cawan-cawan petri dilakukan secara aseptik didalam "biohazard" atau dekat nyala api bunsen untuk menghindari kontaminan dari udara . Pada pembuatan media agar slope (agar miring), media dalam tabung/botol yang masih panas/cair dimiringkan dan diganjal dengan tabung kaca, lalu diatur sedemikian sehingga ujung media tidak terlalu dekat dengan leher botol/tabung .

Media yang dibuat sebelum digunakan harus dikontrol dahulu sterilitasnya, yaitu dengan menyimpan didalam inkubator pada suhu 370C selama 24 jam . Media yang terkontaminasi harus dibuang . Beberapa sampel media yang sudah dikontrol sterilitasnya diuji pertumbuhannya dengan bakteri yang cocok untuk penggunaan media tersebut, misal untuk media agar Brilian green (BRG) digunakan bakteri Salmonella, dan untuk agar Mac Conkey (MCC) digunakan bakteri E.coli . Media yang baik adalah apabila media BRG dengan pertumbuhan Sabnonella harus berubah warna menjadi merah, dan media MCC dengan pertumbuhan E.coli harus berubah menjadi merah . Media-media yang sudah dikontrol sterilitas dan uji pertumbuhannya selaina belum digunakan harus disimpan didalam lemari pendingin (cool room) suhu 50C-80C .

Dalam suatu laboratorium, ada banyak jenis alat – alat yang digunakan, salah satu jenis alat yang sering digunakan dalam laboratorium mikrobiologi adalah alat sterilisasi. Dalam laboratorium, sterilisasi media dilakukan dengan menggunakan autoklaf yang menggunakan tekanan yang disebabkan uap air, sehingga suhu dapat mencapai 1210C. Sterilisasi dapat terlaksana bila mencapai tekanan 15 psi dan suhu 1210C selama 15 menit. Media biakan yang telah disterilkan harus diberi penutup agar tidak dicemari oleh mikroorganisme yang terdapat disekelilingnya (Lay,W.B 1994).

Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang teradapat pada suatu benda. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3 macam, yaitu penggunaan panas (pemijaran dan udara panas); penyaringan; penggunaan bahan kimia (etilena oksida, asam perasetat, formaldehida dan glutaraldehida alkalin) (Hadioetomo,1993).

Bahan ataupun peralatan yang digunakan dalam praktikum mikrobiologi harus dalam keadaan steril (Suriawiria,1995). Yang dimaksud steril berarti pada bahan atau peralata tersebut tidak didapatkan mng tidak diharapkan kehadirannya, baik mikroba yang akan mengganggu atau merusak media ataupun mengganggu kehidupan dan proses yang sedang
dikerjakan (Suriawiria,1995). Steril berarti akan didapatkan melalui sterilisasi, yang berarti proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk kehidupan. Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisika dan kimiawi.

Beberapa macam radiasi dapat bersifat letal (mematikan) terhadap selsel mikroba dan juga sel-sel organisme lain. Radiasi macam ini meliputi bagian dari spektrum elektromagnetik (radiasi ultraviolet, gama, dan sinar X) dan sinar-sinar katode (elektron berkecepatan tinggi). (Michael J. et. Al 2005). Sterilisasi ini menggunakan sinar gelombang pendek (220-290) nm, berguna untuk mensterilkan udara, air, plasma darah. Sinar ultra ungu daya penetrasinya lemah dilewatkan (dialirkan) atau ditempatkan langsung dibawah sinar ultra ungu dalam lapisan-lapisan tipis.

Sterilisasi dengan uap air panas, bahan yang mengandung cairan tidak dapat disterilkan dengan oven sehingga digunakan alat ini. alat ini disebut Arnold steam sterilizer dengan suhu 1000Cdalam keadaan lembab. Secara sederhana dapat pula digunakan dandang. Mula-mula bahan disterilkan pada suhu 1000C selama 30 menit untuk membunuh sel-sel vegetatif mikrobia. kemudian disimpan pada suhu kamr 24 jam untuk memberi kesempatan
spora tumbuh menjadi sel vegetatif, lalu dipanaskan lagi 1000C 30 menit. dan diinkubasi lagi 24 jam dan disterilkan lagi, jadi ada 3 kali sterilisasi. Banyak bakteri berspora belum mati dengan cara ini sehingga dikembangkan cara berikutnya yaitu uap air bertekanan (Machmud 2008).
Sterilisasi bahan yang tidak tahan panas, seperti misalnya ekstrak tanaman, media sintetik tertentu, dan antibiotik dilakukan dengan penyaringan. Dasar metode ini semata-mata ialah proses mekanis yang membersihkan larutan atau suspensi dari segala organisme hidup dengan melewatkannya pada suatu saringan, misalnya menggunakan saringan Seitz. Cara lain untuk sterilisasi ialah menggunakan radiasi. Bahan radiasi yang umum digunakan yaitu sinar gamma (Khopkar 2003).



III. Metodologi
Praktikum Ilmu Penyakit Tanaman, mengenai  Pembuatan Media dan Sterilisasi dilaksanakan di Laboratorium Hama dan Penyakit Fakultas Pertanian, Universitas Tidar, Magelang. Dilaksanakan pada hari Senin 26 September 2016, Pukul 16.00 sampai selesai. Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah petridish,agar, Potongan kentang 200 gram,Dextrose 20 gram, Agar 20 gram, Aquades 1000 ml, autoclave, Beef Agar 3 gram, Peptone 5 gram,Dextrose 10 gram,Yeast ekstrak 5 gram, Agar 20 gram, kertas Ph, lampu bunsen, plastik pembungkus.
Cara Kerja pada praktikum ini adalah pembuatan media PDA untuk menumbuhkan jamur dengan cara Kentang yang sudah dicuci dipotong – potong kemudian direbus dalam air sampai mendidih. Ekstrak kentang dipisahkan dan ditambah aquades sampai volume 1000 ml. Kemudian ditambahkan dextrose dan agar lalu dilarutkan di atas api. Sesudah larutan ekstraknya disaring dengan kain kemudian diisikan ke dalam tabung reaksi steril volume 10 ml untuk agar tegak dan 5 ml untuk agar miring dan disterilkan di dalam autoclave pada suhu 1200 C atau tekanan 1 atm selama 15 – 20 menit. Dan pembuatan media NA dengan cara masukkan semua bahan pada gelas piala kemudian Media diatur pHnya pada 7,2 dan kemudian disterilkan di dalam autoclave pada suhu 1200 Cselama 15 – 20 menit.
IV. Hasil Pengamatan dan Pembahasan
Media adalah suatu substansi yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembang biakan jasad renik (mikroorganisme). Media dapat berbentuk padat, cair dan semi padat (semi solid) .

Nutrient Agar (NA) merupakan suatu medium yang berbentuk padat, yang merupakan perpaduan antara bahan alamiah dan senyawa-senyawa kimia. NA dibuat dari campuran ekstrak daging dan peptone dengan menggunakan agar sebagai pemadat. Dalam hal ini agar digunakan sebagai pemadat, karena sifatnya yang mudah membeku dan mengandung karbohidrat yang berupa galaktam sehingga tidak mudah diuraikan oleh mikroorganisme. Dalam hal ini ekstrak beef dan pepton digunakan sebagai bahan dasar karena merupakan sumber protein, nitrogen, vitamin serta karbohidrat yang sangat dibutuhkan oleh mikroorganisme untuk tumbuh dan berkembang. Medium Nutrient Agar (NA) merupakan medium yang berwarna coklat muda yang memiliki konsistensi yang padat dimana medium ini berasal dari sintetik dan memiliki kegunaan sebagai medium untuk menumbuhkan bakteri.

Medium PDA (Potato Dekstrosa Agar) berdasarkan susunannya merupakan medium organik semi alamiah atau semi sintetis sebab terdiri dari bahan alamiah yang ditambah dengan senyawa kimia; berdasarkan konsistensinya merupakan medium padat karena mengandung agar yang memadatkan medium; berdasarkan kegunaannya merupakan medium
untuk pertumbuhan jamur. Medium PDA terdiri dari kentang yang berfungsi sebagai sumber energi, nitrogen organik, karbon dan vitamin, dekstrosa sebagai sumber karbon, agar sebagai bahan pemadat medium dan aquadest sebagai pelarut untuk menghomogenkan medium dan
sumber O2. Penuangan media yang telah dibuat ke dalam petridish dilakukan dalam kondisi steril agar tidak terjadi kontaminasi (biasanya terjadi akibat tumbuhnya kapang, seperti Penicilium dalam biakan). Media yang dituang hendaknya tidak terlalu panas, karena selain mengganggu proses penuangan juga masih mengeluarkan uap yang akan menempel pada
cawan penutup, sehingga mengganggu proses pengamatan. Pada metode ini, koloni akan tumbuh di dalam media agar. Kultur diletakkan terbalik, dimasukkan di dalam plastik dengan diikat kuat kemudian diletakkan dalam inkubator.

Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang teradapat pada suatu benda. Ada tiga cara utama yang umum dipakai dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas, penggunaan bahan kimia, dan penyaringan (filtrasi). Apabila panas digunakan bersama-sama dengan uap air maka disebut sterilisasi basah, bila tanpa kelembapan maka disebut sterilisasi kering. Medium merupakan bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme diatas atau didalamnya. Sebelum menumbuhkan mikroorganisme, pertama-tama kita harus memahami kebutuhan dasarnya lalu mencoba memformulasikan suatu medium yang memberikan hasil baik. Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan percobaan untuk menambah pengetahuan tentang cara pembuatan medium dan juga cara menstrilisasikan medium. Autoklaf adalah alat yang digunakan untuk sterilisasi. Autoklaf termasuk dalam teknik sterilisasi secara fisika dengan prinsip arus uap dan tekanan. Alat ini sering digunakan dalam teknik pensterilan karena tingkat koefisien dan sifat alat yang tidak merusak kandungan dalam media pertumbuhan yang dipakai yaitu NA, PDA.  Sterilisasi yang dilakukan bertujuan untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan. Sterilisasi merupakan suatu proses (kimia dan fisika) yang membunuh semua bentuk hidup terutama mikroorganisme.

Sterilisasi secara fisika yang menggunakan arus uap dan tekanan yang tinggi untuk mematikan mikroorganisme. Alat yang memakai prinsip ini adalah autoklaf. Uap panas dapat mematikan mikroorganisme karena mikroorganisme mengandung senyawa protein yang akan mengalami degradasi jika terkena panas. Dalam proses ini juga memerlukan tekanan sehingga arus panasnya dapat menembus kista atau dinding pelindung mikroba.
Sebelum peralatan di masukkan ke dalam autoklaf.  untuk proses sterilisasi, maka terlebih dahulu peralatan tersebut bersihkan dengan cara dicuci, kemudian alat yang sudah bersih dibungkus dengan menggunakan kertas sampul coklat dan untuk erlenmeyer dan tabung reaksi disumbat mulutnya menggunakan kapas, dimana tujuan dari pembungkusan dengan menggunakan kertas sampul coklat dan penyumbatan ini adalah:
1. Untuk menghindari kontaminasi karena bagian mulut adalah bagian yang rentan kontaminasi.
2. Agar mikroba tidak dapat masuk berdasarkan luas area kontak dengan udara.
3. Untuk mencegah penguapan air pada bagian mengkilap karena bagian mengkilap dapat menyerap cahaya.
4. Menjaga semua alat dan bagiannya dalam kondisi bersih dan steril dan siap digunakan setiap waktu, dan terjaga dari kontaminan lingkungan.
5. Untuk menyerap air dari uap panas yang dikeluarkan autoklaf.

Kemudian alat-alat yang akan disterilisasi dimasukkan ke dalam autoklaf selama 15sampai 20 menit. Batas air bawah rak kukus harus diperiksa karena batas air di dalam rak kukus harus berlebih untuk membentuk uap air yang jenuh. Suhu autoclave dalam percobaan ini adalah 1200C, dengan demikian maka segala bentuk mikroorganisme dapat dimatikan.

Autoclave menggunakan uap air murni (lebih ringan dan lebih panas dari udara) untuk sterilisasi sehingga udara yang terdapat dalam wadah harus dikeluarkan. Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoclave lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoclave. Setelah semua udara dalam autoclave diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoclave naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga sama dengan tekanan atmosfer. Autoclave tidak boleh dibuka sebelum tekanan turun sampai nol. Hal yang sering keliru adalah dengan menutup semua katup rapat-rapat sebelum udara dalam wadah digantikan oleh uap air. Adanya udara dalam wadah saat sterilisasi dapat mengakibatkan kurang efisiennya sterilisasi. Autoclave hanya dapat mencapai suhu maksimal pada kondisi uap air murni. Grafik berikut menggambarkan penurunan suhu jika terdapat campuran udara pada wadah autoclave saat sterilisasi.

Setelah peralatan dan media padat selesai disterilisasikan dengan menggunakan autoclave, selanjutnya proses penanaman bakteri. Terlebih dahulu media padat yang telah homogen dituang ke dalam petridish dan tabung reaksi. Kemudian media padat didinginkan sejenak hingga mengeras di dalam clean bench. Pada saat didiamkan posisi tabung reaksi dimiringkan. Hal ini bertujuan untuk memperluas bidang permukaan dari media padat didalam tabung reaksi. Setelah media padat mengeras dituangkan media cair ke dalam petridish dan tabung reaksi yang berisikan media padat, yang sebelumnya telah dibuat goresan pada media padat tersebut. Dibuat tempelan bakteri dan jamur pada media padat.

V. Kesimpulan
Kesimpulan yang didapat pada praktikum pembuatan media dan sterilisasi ini adalah sebagai berikut:
1.    Alat dan bahan yang akan digunakan untuk membuat media haruslah steril.
2.     Media harus mengandung nutrien.
3.     Media harus memiliki pH dan osmotik yang sesuai dengan mikroorganisme.
4.    Media PDA dan NA digunakan untuk memelihara dan pertumbuhan mikroorganisme.















DAFTAR PUSTAKA
Anonymous 1982. The Oxoid Manual of Culture Media, Ingredients and other Laboratory Service, Fifth edition.Basingstok -England.
Collin.CH and Patricia M .Lyne 1987 Microbiological Method, Fifth edition . Butterworths, London .
Cowan ST 1975, Cowan and Steel's Manual for identification of medical bacteria Second edition, Cambridge University Press . Cambridge .
Dwidjoseputro, D. 2002. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan,Malang.
Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta.
Khopkar, S.M 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Universitas Indonesia. Jakarta.
Kusnadi. 2003. Mikrobiologi. JICA, Malang.
Lay, W. B. (1994). Analisis Mikrobiologi di Laboratorium. Jakarta : Penerbit PT. Raja Grafindo Persada. Hal. 32, 71-73.
Machmud, M. 2008. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba. Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan, Bogor.
Michael J. dan E.C.S. Cha 2005. Dasar-dasar Mikrobiologi Jilid 2. Jakarta: UIPress.
Mila. 2005. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Erlangga, Jakarta.
Schegel, G.H. 1993. General Microbiologi seventh edition. Cambrige University Press, USA.
Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Jakarta :Papas Sinar Sinanti
Suryanto. 2006. Bahan Ajar : Mikrobiologi.USU-Press, Medan.

Sutarma.2000. Jurnal Teknik Pembuatan Kultur Media Bakteri, Yusuf  Hidayat dan Sutarma,Balai Penelitian Veteriner, JL.R.E Martadinata,30 Bogor 16114


Unus Suriawiria .1995. Pengantar Mikrobiologi Umum. Bandung. Angkasa
Yusuf Hidayat. Jurnal Teknik Pembuatan Kultur Media Bakteri. Balai Penelitian Veteriner, JL.R.E Martadinata,30 Bogor 16114